霉菌廣泛分布于土壤、水、空氣等自然環(huán)境中。由于霉菌孢子可以較長(cháng)時(shí)間存活于空氣中，并通過(guò)空氣傳播給其他物質(zhì)，因此無(wú)所不在，防不勝防，給人類(lèi)的生活和健康帶來(lái)很多危害。霉菌及霉菌毒素污染所造成的損失早已引起人們的高度重視，特別是食品衛生領(lǐng)域，近年來(lái)世界各國紛紛制訂多種食品中毒菌及霉菌毒素的限量標準，同時(shí)加強對霉菌檢測技術(shù)的研究，并不斷提出新的見(jiàn)解，完善該項技術(shù)。

早在我國1997頒布的國家標準GB16740-1997中，就已經(jīng)將所有的保健食品都增加了霉菌指標。各級食品衛生檢測機構也都全面開(kāi)展霉菌的檢測工作。由于霉菌檢測技術(shù)起步較晚，加上其生理和形態(tài)的多樣化和復雜性，至今仍有不少基本的問(wèn)題得不到很好的解決。近年來(lái)，這方面的研究進(jìn)展很快，國內外不少學(xué)者提出了許多改進(jìn)措施，為了更好地解決霉菌檢測過(guò)程中遇見(jiàn)的各種問(wèn)題，本文根據作者的實(shí)驗觀(guān)察，并結合國內外有關(guān)研究的最新進(jìn)展，對霉菌檢測過(guò)程中幾個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題試作全面的探討。

一、培養基的選擇

培養基的選擇應根據實(shí)驗材料和檢驗目的來(lái)確定。目前國標方法中使用的培養基有：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)、孟加拉培養基(RBC)、高鹽察氏培養基(CAO)，其中PDA和RBC適合于一般的霉菌和酵母菌生長(cháng)，而CAO則適合于高滲性霉菌生長(cháng)，酵母菌幾乎不長(cháng)。

在日常檢測中我們發(fā)現，有些常見(jiàn)的耐高滲性霉菌，如局限曲霉、謝瓦曲霉、赤曲霉、Wallemia等在PDA、RBC上生長(cháng)非常緩慢或不長(cháng)，而這些菌在高滲培養基如M40Y、DG18(M40Y瓊脂配方：蔗糖400g，麥芽提取汁20g，酵母提取汁5g，瓊脂20g，氯霉素50mg，蒸餾水1000ml；DG18瓊脂配方：葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.5g，氯霉素0.1g，0.2%二氯硝基苯胺1.0mL，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，PH6.5)上則正常生長(cháng)。孢子、形態(tài)特征發(fā)育良好，而且酵母菌也能在M40Y、DG18上生長(cháng)，因此，若能同時(shí)采用PDA和M40Y(或DG18)分離培養各類(lèi)樣品中的霉菌，將能更全面地反映出污染霉菌的菌相。特別是對干燥食品、高糖食品、淹漬食品等，更有必要同時(shí)采用M40Y或DG18。

由于霉菌中很多種類(lèi)不會(huì )產(chǎn)生有毒的霉菌毒素，危害較小，而有的菌株即使污染數量不多，但其產(chǎn)生的霉菌毒素卻危害較大，因此僅作霉菌計數并不能全面反映其危害程度，重要的是要知道污染菌的菌相，才能更好地判斷被污染食品的安全程度。

為此，國外有些研究者設計出各類(lèi)選擇性培養基，可以識別產(chǎn)毒的霉菌。如AFPA培養基(配方：酵母提取汁20g,蛋白胨10g,檸檬酸鐵銨0.5g,0.2%二氯硝基苯胺1.0mL,瓊脂15g,蒸餾水1000mL,PH5.6)用于分離黃曲霉毒素產(chǎn)生菌高污染率的食品。產(chǎn)黃曲霉毒素的菌株黃曲霉和寄生曲霉在A(yíng)FPA上30℃培養2~3天就形成背面有亮橙黃色的特征性菌落，非常容易識別。有人利用該培養基分離黃曲霉高污染食品花生、玉米等,取得了滿(mǎn)意的結果。因此,針對不同樣品,有目的地設計出相應的選擇性培養基,以篩選污染菌中的危險菌群,將是一個(gè)值得探索的方向。

二、接種方式

接種方式主要有傾注法和涂布法兩種。目前國際方法中采用傾注法，但近來(lái)國際上有不少學(xué)者認為霉菌計數采用涂布法更合適。

Beuchat和Matsuda等人分別對這兩種方法作了大量比較試驗后發(fā)現，對霉菌計數來(lái)說(shuō)，涂抹法有以下幾方面優(yōu)越于傾注法：①培養出的霉菌菌落數較多；②培養所需的時(shí)間較短；③霉菌孢子、菌落形態(tài)特征發(fā)育完全，便于鑒定。這是因為絕大多數霉菌是好氧的，在培養基表面生長(cháng)快，發(fā)育好，而混在培養基中發(fā)育就受影響，而且在培養基傾注時(shí)霉菌孢子易受熱損傷。我們在自己的實(shí)驗室也做了類(lèi)似的比較試驗，通過(guò)對30種常見(jiàn)霉菌的試驗證實(shí)了上述的結論。因此，我們認為，霉菌計數采用涂布法既準確又省時(shí)，值得推廣。

三、培養溫度

經(jīng)對多種常見(jiàn)霉菌的最適生長(cháng)溫度作了調查發(fā)現，大部分菌種的最適溫度為25~30℃。但一些產(chǎn)曲霉毒素的菌株或動(dòng)物致病菌則需要更高的溫度，如黃曲霉35℃、構巢曲霉33℃、煙曲霉37℃、小孢子菌35℃。因此，培養溫度也應根據培養目的而定，一般情況下都采用25~28℃培養，若有特殊培養目的，則應適當調節培養溫度。

四、培養時(shí)間

我們對30種常見(jiàn)霉菌的生長(cháng)速度作了調查，正常培養條件下，培養3~4天的菌落數與5~7天的基本相同，但菌種的特征不明顯，因此，如果只要作霉菌計數，培養3~4天已基本達到目的，但如果還要進(jìn)一步分類(lèi)鑒定，則需要培養更長(cháng)的時(shí)間(7~14天)。必須特別注意的是，有幾類(lèi)生長(cháng)特別快、菌絲很多的菌，則必需在48小時(shí)以?xún)扔嫈?，否則菌絲就會(huì )覆蓋整個(gè)平皿，無(wú)法準確計數。這類(lèi)菌主要有：毛霉、根霉、犁頭霉、共頭霉、木霉等濕度較大的樣品，這類(lèi)菌污染較多，檢測這類(lèi)樣品，應提早觀(guān)察記錄。

五、最適計數范圍

霉菌菌落由孢子和菌絲組成，相當擴散，在直徑9cm的平皿里，菌落數稍多就相互交叉重疊，影響計數，但數量太少又會(huì )產(chǎn)生較大的誤差，因此選擇適當的稀釋度計數是保證結果準確的關(guān)鍵環(huán)節之一。

我們對這方面作了一些觀(guān)察研究，首先是將實(shí)驗菌株的斜面培養物制成含有約10⁶個(gè)/ml的孢子懸液，并用血球計數器在顯微鏡下準確計數，然后將孢子懸液作10^-1~10^-6倍稀釋?zhuān)〔煌♂尪鹊南♂屢航臃N于PDA，25℃培養5天后計數。30種常見(jiàn)霉菌的兩種不同計數方法所得結果比較顯示，大部分菌株每平板含有10~50個(gè)菌落的稀釋度時(shí)的計數與顯微鏡計數結果最接近；有近一半的菌株，每個(gè)平板含50~100個(gè)菌落已較難計數，而大部分菌株，超過(guò)100個(gè)/平皿或小于10個(gè)/平皿的計數結果就與顯微計數結果存在較大差別，因此，應盡量選擇10~50個(gè)/平皿的稀釋度進(jìn)行霉菌計數。

而對上述提及的菌絲很豐富、菌落特別擴散的毛霉、根霉、犁頭霉等菌株，則應在更少的范圍內計數(30個(gè)/平皿以?xún)?。為控制霉菌的生長(cháng)速度和菌落的生長(cháng)范圍，可在培養基中添加少量抗生素，如氯霉素(50~100mg/L)，金霉素(20~100mg/L)，慶大霉素(50mg/L)，土霉素(100mg/L)等。

六、霉菌檢測過(guò)程中應特別注意的事項

1、由于霉菌檢測所需的時(shí)間較長(cháng)，中間又需要多次觀(guān)察，因此實(shí)驗前一定要作好實(shí)驗計劃，明確觀(guān)察記錄的時(shí)間。

2、霉菌孢子通過(guò)空氣傳播，所以實(shí)驗時(shí)應保持實(shí)驗室平靜，減少空氣流通；操作時(shí)手腳要快，動(dòng)作要輕，特別是培養過(guò)程中，如果觀(guān)察時(shí)動(dòng)作過(guò)大，早期生長(cháng)出的霉菌孢子就會(huì )在培養基內擴散，形成新的菌落，導致結果不準確。

3、實(shí)驗前應認真做好全面的消毒工作，包括操作人員手指、實(shí)驗室空間、實(shí)驗臺等，實(shí)驗后應第一時(shí)間將有霉菌的培養物高壓滅菌，防止進(jìn)一步擴散。

4、對使用的菌株的生理、生態(tài)、形態(tài)、毒理、致病性必需有充分的了解，并作好相應的防擴措施,防止污染其它物品。